Kako poboljšati osjetljivost RT-PCR reakcije za detekciju RNK

U procesu provođenja genetskih studija često se susrećemo s nedostatkom uzoraka RNK, na primjer, za proučavanje sićušnih anatomskih oralnih tumora, čak i jednoćelijskih uzoraka i uzoraka specifičnih genskih mutacija koje se transkribiraju na vrlo niskim razinama u ljudskim stanicama.Naravno, za Covid-19 test, ako brisevi nisu na pravom mjestu ili nedovoljno vremena tokom uzorkovanja, veličina uzorka će biti vrlo mala, zbog čega je Komisija za zdravlje i planiranje porodice izašla prije dva dana i je prošao test, a ako uzorkovalac nukleinske kiseline nije uzeo šest uzoraka, možete to prijaviti.

Osjetljivost reagensa je važna jer imamo ovaj ili onaj problem, pa šta možemo učiniti da poboljšamo osjetljivost RT-PCR?

Prije nego što razgovaramo o mogućim rješenjima, spomenimo dvije velike komplikacije sa situacijom koju smo upravo spomenuli.

Prije svega, brinemo o gubitku RNK kada imamo samo nekoliko populacija stanica u našem uzorku.Ako se koriste tradicionalne metode odvajanja i čišćenja, kao što je metoda kolone ili metoda precipitacije nukleinske kiseline, postoji velika mogućnost da će nekoliko uzoraka biti izgubljeno.Jedno rješenje je dodavanje molekula nosača, kao što je tRNA, ali čak ni tada nema garancije da je naš eksperiment oporavka u redu.

Dakle, koji je bolji način?Dobra opcija za kultivisane ćelije ili mikroanatomske uzorke je upotreba direktne lize.

Ideja je podijeliti ćelije na 5 minuta, pustiti RNK u otopinu, zatim zaustaviti reakciju na 2 minute, zatim dodati lizat direktno u reakciju reverzne transkripcije tako da se RNK ne izgubi, i na kraju direktno staviti rezultirajuću cDNK u reakciju u realnom vremenu.

Ali šta ako, zbog ograničene početne tačke ili male količine ekspresije ciljnog gena, možemo reciklirati svu RNK, a da i dalje ne obezbedimo dovoljno šablona da bismo dobili dobar signal u realnom vremenu?

U ovom slučaju, korak pre-amplifikacije može biti vrlo koristan.

Slijedi šema za povećanje osjetljivosti nakon reverzne transkripcije.Prije nego što počnemo, moramo pitati nizvodno koje mete nas zanimaju, kako bismo dizajnirali specifične prajmere za ove mete za pre-amplifikaciju.

Ovo se može postići stvaranjem mješovitog prajmera sa do 100 pari prajmera i reakcionim ciklusom od 10 do 14 puta.Stoga je Master Mix posebno dizajniran za ovaj zahtjev potreban za pre-amplifikaciju dobivene cDNK.

Razlog za postavljanje broja ciklusa između 10 i 14 je taj što ovaj ograničeni broj ciklusa osigurava slučajnost između različitih ciljeva, što je ključno za istraživače kojima su potrebne kvantitativne molekularne informacije.

Nakon pre-amplifikacije, možemo dobiti veliku količinu cDNK, tako da je osjetljivost detekcije na back-endu znatno poboljšana, a možemo čak i razrijediti uzorak i izvesti višestruke PCR reakcije u realnom vremenu kako bismo eliminirali moguće slučajne greške.